Description
Le tampon PHEM est principalement utilisé pour les tissus et les cultures cellulaires traités pour des études d’immunocoloration immunocytochimique.
La plupart des antigènes, en particulier les antigènes intracellulaires, se colorent plus efficacement avec le tampon PHEM qu’avec le tampon PBS. Il a également un effet plus limité sur les réactions biochimiques et les enzymes.
Un avantage significatif de l’utilisation du PHEM est son excellente préservation de l’ultrastructure cellulaire, en particulier des microtubules.
Références : Schliwa, Manfred, et Jonathan Van Blerkom. « Interaction structurelle des composants du cytosquelette ». The Journal of Cell Biology 90.1 (1981): 222-235. Jacqueline Montanaro : Amélioration de l’ultrastructure des invertébrés marins à l’aide de tampons non toxiques.
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Immunofluorescence : Conseils d’experts sur l’immunomarquage en culture cellulaire
par Nancy Kedersha
Les chercheurs qui se lancent dans l’immunomarquage sont confrontés à une série de défis techniques qui peuvent faire la différence entre l’obtention d’images claires et informatives, un désordre confus ou pas de signal du tout », explique Nancy Kedersha, maître de conférences en médecine à la Harvard Med School et directrice de la microscopie confocale au Brigham and Women’s Hospital. « Pire encore, le résultat pourrait être quelque chose qui semble très spécifique mais qui est trompeur ou tout simplement faux ».
Dans ce billet, Nancy partage ses conseils d’expert sur l’immunomarquage et souligne les points clés à prendre en compte lors de la planification de vos expériences d’imagerie utilisant des cellules cultivées.
Trouvez le bon environnement de travail… (AKA, optimisez vos tampons.)
Les anticorps sont optimisés par le système immunitaire pour fonctionner dans l’environnement riche en sodium du sang – c’est pourquoi la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est généralement le tampon de choix pour la coloration des cellules de surface. Cependant, le milieu intracellulaire est dominé par le potassium et il faut s’efforcer de recréer ces conditions.
Le système de tampon utilisé pendant les incubations et les lavages après la fixation (voir ci-dessous) et la perméabilisation peut faire une énorme différence dans l’intensité du signal. Des tampons tels que PHEM ou CSK ont été mis au point pour les cellules perméabilisées et non fixées dans le cadre d’essais basés sur la fonction. Ces tampons peuvent être utilisés sur des cellules fixées et perméabilisées à la place du PBS et sont particulièrement utiles pour les antigènes cytosquelettiques ou cytoplasmiques.
En termes d’intensité du signal (d’après ma propre expérience), environ 10 % des antigènes cellulaires se colorent nettement mieux dans le tampon PHEM que dans le PBS, 50 % se colorent modérément mieux dans le tampon PHEM et 30 % ne présentent aucune différence. Les 10 % restants se colorent beaucoup mieux dans le PBS ! C’est pourquoi j’essaie régulièrement le PHEM et le PBS lorsque j’utilise un anticorps pour la première fois. Il existe également une sélection d’autres tampons que vous pouvez expérimenter (voir ci-dessous).
