Description
Le tampon PHEM est principalement utilisé pour les tissus et les cultures cellulaires lors d’études de coloration immunocytochimique.
La plupart des antigènes, en particulier les antigènes intracellulaires, présentent une meilleure coloration avec le tampon PHEM qu’avec le tampon PBS. Il a également un impact plus limité sur les réactions biochimiques et les enzymes.
L’utilisation de PHEM garantit également une excellente préservation de l’ultrastructure cellulaire, en particulier des microtubules.
Références :
Schliwa, Manfred et al. « Interaction structurelle des composants du cytosquelette ». The Journal of Cell Biology 90.1 (1981): 222-235.
Jacqueline Montanaro : Amélioration de l’ultrastructure des invertébrés marins à l’aide de tampons non toxiques.
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Immunofluorescence : Conseils pour l’immunomarquage des cellules
Conseils d’experts sur l’immunomarquage
Par Nancy Kedersha PHEM Buffer
Les chercheurs qui se lancent dans l’immunomarquage sont confrontés à une série d’obstacles techniques qui peuvent faire la différence entre l’obtention d’images claires et informatives ou un désordre chaotique, voire l’absence totale de signal… », explique Nancy Kedersha, professeur de médecine à la Harvard Med School et directrice de la microscopie confocale à l’hôpital Brigham and Women’s Hospital. « Le pire, c’est que le résultat peut sembler très précis mais être trompeur ou tout simplement faux.
Dans cet article de blog invité, Nancy offre ses conseils d’expert sur l’immunomarquage et souligne les facteurs à prendre en compte lors de la planification de vos expériences d’imagerie utilisant des cellules cultivées…
Trouver le bon environnement de travail…
(… AKA, optimisez vos tampons.)
Les anticorps sont optimisés par le système immunitaire pour fonctionner dans l’environnement riche en sodium du sang – c’est pourquoi la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est généralement le tampon de choix pour la coloration de la surface des cellules. However, the intracellular environment is dominated by potassium, and efforts must be made to recreate these conditions.
Le système de tampon utilisé pendant les incubations et les lavages après la fixation (voir ci-dessous) et la perméabilisation peut faire une grande différence dans l’intensité du signal. Des tampons tels que le PHEM ou le CSK ont été mis au point pour les cellules perméabilisées et non fixées dans les essais basés sur la fonction ; ces tampons peuvent être utilisés sur des cellules fixées et perméabilisées à la place du PBS et sont particulièrement utiles pour les antigènes cytosquelettiques ou cytoplasmiques.
En termes d’intensité du signal (d’après ma propre expérience), environ 10 % des antigènes cellulaires présentent une bien meilleure coloration dans le tampon PHEM que dans le PBS, 50 % présentent une coloration modérément meilleure dans le tampon PHEM et 30 % ne présentent aucune différence. Les 10 % restants se colorent beaucoup mieux dans le PBS ! C’est pourquoi j’essaie régulièrement le PHEM et le PBS lorsque j’utilise un anticorps pour la première fois. Il existe également une sélection d’autres tampons que vous pouvez expérimenter (voir ci-dessous).
Tampon:
Tampon PHEM : Pipes 60 mM, Hepes 25 mM, EGTA 10 mM, MgCl2 2 mM, pH 6.9 : acronyme pour PIPES, HEPES, EGTA et MgCl2.
