Domande frequenti

Per una buona pratica sperimentale in laboratorio, è indispensabile tenere conto della temperatura dei reagenti. Lasciare sempre che i reagenti tornino a temperatura ambiente in laboratorio (generalmente tra 18 e 22°C) prima di iniziare il protocollo sperimentale. Ciò garantirà una migliore riproducibilità dei risultati, considerando non solo le concentrazioni ma anche i parametri di temperatura e tempo di reazione.

L’acqua è essenziale per la ricerca nel campo delle scienze della vita, ma per molti scienziati la riflessione più importante su questo reagente di laboratorio più utilizzato è “quanta me ne serve?”. Poiché l’acqua è in grado di fungere da solvente per molte sostanze e reagenti (soluzione acquosa), bisogna fare attenzione che possa contaminarsi. L’acqua può anche essere un mezzo di diluizione. Anche all’interno dello stesso laboratorio, l’acqua utilizzata in un esperimento può essere diversa da quella utilizzata in un altro. Esiste una moltitudine di metodi, dispositivi e mezzi per produrre acqua purificata, quindi dovremo specificare i mezzi di produzione di quest’acqua. Non tutta l’acqua è uguale, quindi considerate l’acqua come un reagente di laboratorio ed esaminatela di conseguenza. Comprendere l’importanza della qualità dell’acqua e monitorarla attentamente è importante per garantire la riproducibilità degli esperimenti per diversi giorni, mesi e persino anni.

Il numero CAS (o numero di registro CAS) di una sostanza chimica, di un polimero, di una sequenza biologica o di una lega è il suo numero unico di registrazione nel database del Chemical Abstracts Service (CAS), una divisione dell’American Chemical Society (ACS). Il CAS assegna questi numeri a ogni sostanza chimica descritta nella documentazione. Il CAS gestisce e commercializza anche un database di queste sostanze, il CAS Registry.

L’American Chemical Society (ACS), con oltre 150.000 membri, è una delle più grandi organizzazioni scientifiche del mondo e una delle principali fonti di informazioni scientifiche autorevoli sulla chimica. Pubblica riferimenti, ordina e descrive ogni prodotto ACS secondo un metodo standardizzato. Se avete bisogno di informazioni più dettagliate su un prodotto chimico con etichetta ACS, potete trovare la sua composizione esatta nel database disponibile gratuitamente sul sito web https://www.acs.org/content/acs/en.html.

Le soluzioni microfiltrate sono prodotte per filtrazione sotto vuoto su una membrana (dispositivo di filtrazione). Le membrane utilizzate per filtrare una soluzione acquosa sono costituite da un filtro a base di cellulosa (estere di cellulosa), con un diametro adatto al dispositivo di filtrazione e una porosità di 0,4µ o 0,2µ (la porosità di 0,2µ consente anche di trattenere i batteri (da qui il metodo di sterilizzazione).

I compartimenti cellulari operano a livelli di pH prossimi a 7. Non esiste un pH universale per la fissazione.

Una soluzione madre è generalmente una soluzione concentrata che può essere diluita per ottenere soluzioni figlie meno concentrate. Esempio: preparare una soluzione madre da 0,2 M per ottenere un tampone fosfato da 0,1 M (soluzione figlia), una soluzione madre da 0,4 M per ottenere una soluzione figlia da 0,2 M.

Tutti i prodotti in commercio hanno generalmente una data di scadenza. Questo non significa necessariamente che non si possano utilizzare dopo tale data. La data di scadenza è la data in cui scade la garanzia del fornitore sul prodotto. Tutti noi abbiamo fatto questa prova, a volte utilizzando prodotti chimici scaduti da diversi anni, e il risultato è stato eccellente (ha generato meno rifiuti). È importante ricordare che la durata di conservazione dei prodotti dipende in larga misura dall’imballaggio e dallo stoccaggio.

EM-grade vuole essere un attore eco-responsabile nel settore della microscopia elettronica, promuovendo l’uso razionale dei prodotti chimici che hanno un duplice impatto sull’ambiente e sulla salute.

Se non possiamo fare a meno di alcuni prodotti talvolta tossici, allora consumiamoli meglio e meno spesso.

Per questo motivo preferiamo vendere prodotti in piccoli volumi e confezioni di dimensioni ridotte, per evitare di accumularli per anni nei rifiuti di laboratorio.

I professionisti del laboratorio non sono grandi consumatori di confezioni piccole per due motivi principali:

Il timore di rimanere senza prodotto durante le operazioni di manipolazione.

Il costo più elevato dei prodotti, rispetto agli acquisti in blocco.

EM grade garantisce la spedizione entro 24 ore (senza guasti) e prezzi ragionevoli per tutte le quantità.

La Tavola periodica degli elementi, nota anche come Tavola di Mendeleev, Tavola periodica o semplicemente Tavola periodica, rappresenta tutti gli elementi chimici, ordinati per numero atomico crescente e organizzati secondo la loro configurazione elettronica, che è alla base delle loro proprietà chimiche.

L’ideazione di questa tavola è generalmente attribuita al chimico russo Dimitri Ivanovitch Mendeleev.

Un gas neutro (inerte) è un gas stabile (cioè ha già 8 elettroni di valenza nel suo guscio esterno e non ha bisogno di reagire per raggiungere questi 8 elettroni). Questi gas sono noti anche come gas nobili o rari. Non innescano reazioni chimiche da soli (l’azoto è un gas inerte, così come l’argon, il più utilizzato nelle condizioni di EM Grade).

Quando il tampone ha una concentrazione elevata, da 0,4 molare in su, può cristallizzare in una certa misura se conservato in frigorifero. Questa condizione è reversibile, poiché i cristalli si dissolvono entro poche ore a temperatura ambiente. È possibile riscaldarlo nuovamente per accelerare la scomparsa dei cristalli. Questa cristallizzazione non modifica le proprietà chimiche del tampone.

DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) PBS (Phosphate Buffer Saline). A causa di vincoli di osmolarità associati al fissativo, o a scopo di risciacquo, viene generalmente preparato a 0,1M o 0,2M a un pH di circa 7-7,4, per compensare la leggera acidità rilasciata dalle cellule durante la fissazione. Il DPBS (sviluppato da Dulbecco) può contenere additivi CaCl2 e MgCl2 per facilitare il distacco delle cellule in coltura. Se il DPBS non contiene questi additivi, può essere sostituito dal PBS.

Il calcio e il magnesio facilitano il legame e l’agglutinazione delle cellule (facilitando il recupero delle cellule nella coltura in piastra). Nota bene :

• Il D-PBS ha generalmente una concentrazione di fosfati leggermente inferiore a quella del PBS,
• Il DPBS può includere o meno calcio e/o magnesio. Le esigenze sperimentali determineranno la soluzione da utilizzare.

Ad esempio, se in un particolare esperimento si deve misurare l’attività enzimatica della tripsina, il calcio e il magnesio talvolta presenti nel DPBS possono falsare i risultati, per cui sarebbe preferibile il PBS semplice.

I tamponi fosfatici sono le soluzioni più utilizzate in biologia, in quanto non sono tossici. Tuttavia, questa atossicità può favorire lo sviluppo di microrganismi nel medio termine. Questo inconveniente può essere superato preparando soluzioni di riserva con alte concentrazioni di 0,4M, 1M e oltre, poiché i microrganismi non proliferano in alte concentrazioni di sale (con poche eccezioni).

I tamponi a base di fosfati si contaminano dopo alcuni mesi (da 2 a 3 mesi al massimo), poiché sono vitali. Possono essere decontaminati e continuare a essere utilizzati semplicemente filtrando a 0,22µ (filtro per siringa, ecc.). Conservare a 4-8°C.

Non è un tampone vitale, poiché contiene tracce di elementi tossici come l’arsenico. Tuttavia, è ancora ampiamente utilizzato quando si fissano le cellule (poiché la fissazione uccide la cellula). In questo caso, la tossicità del cacodilato non è più uno svantaggio. Al contrario, la sua tossicità diventa un vantaggio, grazie alla sua facilità di preparazione. Ha una lunga durata di conservazione (tossico per i microrganismi) e non richiede sterilizzazione.

L’utilità del tetrossido di osmio tamponato con imidazolo come conservante lipidico nella microscopia elettronica a trasmissione è altamente raccomandata, in quanto l’imidazolo consente la ritenzione e il mantenimento dei lipidi anche dopo disidratazione alcolica. A titolo di esempio, il fegato di ratto e altri tessuti sono stati fissati per perfusione con glutaraldeide e post-fissati con osmio-imidazolo, e l’aspetto delle goccioline lipidiche è stato confrontato con quello dopo la fissazione in tetrossido di osmio acquoso non tamponato con imidazolo. Dopo la postfissazione con osmio-imidazolo all’1% 0,1M, a pH 7,5, per 30 minuti, è stata osservata una marcata colorazione elettronopaca delle goccioline lipidiche e delle particelle lipoproteiche (per maggiori dettagli, vedere il protocollo).

Gestite meglio le vostre scorte di sostanze chimiche con un semplice inventario quantificato per anticipare gli acquisti.

Raggruppate i vostri acquisti per risparmiare, ma soprattutto per limitare l’impatto delle emissioni di carbonio sul pianeta.

Spesso negoziamo i costi di consegna senza considerare l’impatto sull’ambiente.

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In 1966, Norman Good and his colleagues set out to define the best buffers for biochemical systems.

In 1980, Good and his colleagues identified twenty buffers that set the standard for use in the biological and biochemical research we now use in microscopy to fix tissues.

A volte la conservazione dei vostri assorbenti vitali (fosfato, PHEM,…), superata la data di scadenza (garanzia), può essere contaminata dalla proliferazione di batteri o muffe. Questo stato di contaminazione non diminuisce in alcun modo le proprietà dei vostri assorbenti. È sufficiente rifiltrare a 0,22µm o autoclavare la soluzione tampone. Una volta trattati, i tamponi sono sicuri da usare.

EM Grade significa che questo prodotto è qualificato per l’uso nella preparazione di campioni da esaminare al microscopio elettronico.

Un prodotto di grado EM. deve essere:

• elevata purezza chimica e distillato
• sigillato in un’atmosfera neutra (saturata con un gas neutro come Argon o Azoto) senza contatto con l’aria, né ossigeno né CO2 (AirLess)

Per piccoli volumi, sigilliamo in un’ampolla o in una bottiglia Airless. Per volumi maggiori, iniettiamo argon o azoto, saturando il liquido facendo gorgogliare la soluzione imbottigliata per sostituire l’ossigeno o l’anidride carbonica contenuti nell’acqua. Ma quando si apre la bottiglia, si perde l’atmosfera neutra. Ecco perché vendiamo piccoli volumi per evitare sprechi. Non c’è rischio di esaurire i prodotti per i vostri esperimenti, perché vengono prodotti il giorno stesso dell’ordine e spediti immediatamente.

L’aria contiene ossigeno, il principale agente ossidante in natura, che degrada i componenti del prodotto. L’ossigeno e un po’ di CO2 (aria) sono sostituiti da gas neutri come l’argon o l’azoto. In questo modo il prodotto si conserva più a lungo, se non si apre la bottiglia. Per questo motivo, è meglio acquistare piccoli volumi, in modo da avere sempre prodotti efficaci quando servono.

Fissare le cellule significa conservarle in uno stato il più possibile simile a quello di vita. Per fissare le proteine e altri componenti cellulari si utilizzano sostanze chimiche.

La soluzione fissativa è generalmente una miscela di fissativo, tampone e vari additivi, se specificato nel protocollo.

Pronta all’uso: cioè la concentrazione dei fissativi, la molarità e il tipo di tampone aggiustati al pH richiesto (secondo il vostro protocollo), tenendo conto dell’osmolarità finale della soluzione, da poche centinaia di milliOsmoli per piante, invertebrati e mammiferi, a un migliaio di milliOsmoli per le specie acquatiche o marine.

Le aldeidi sono i fissativi più comunemente utilizzati. Vengono utilizzati per stabilizzare i dettagli strutturali più fini di cellule e tessuti prima dell’esame in microscopia ottica o elettronica. Possono essere indicati come fissativi primari, come il ParaFormAldehyde (PFA), la Glutaraldeide o la loro miscela di Karnovsky.

Miscele contenenti paraformaldeide (PFA) e glutaraldeide La combinazione di paraformaldeide e glutaraldeide come fissativo per la microscopia elettronica beneficia della rapida penetrazione di piccole molecole di HCHO, che avviano la stabilizzazione della struttura del tessuto. La reticolazione rapida e completa è causata dagli oligomeri di glutaraldeide che penetrano più lentamente. Questa miscela è associata al nome di Morris J. Karnovsky di Boston. Si tratta di un esempio di grande innovazione che è stato pubblicato solo in un abstract non confidenziale (Karnovsky, 1965). La sua miscela originale conteneva il 4% di glutaraldeide, una concentrazione superiore a quella che molti volevano utilizzare (Hayat, 1981). Denominazioni come “Karnovsky a mezza forza” divennero di uso comune negli anni ’60 e ’70. I fissativi primari hanno contribuito a risolvere le osservazioni di tessuti difficili da conservare in microscopia elettronica. l’introduzione dei fissativi Karnovsky, e sono ancora comunemente utilizzati.

Le aldeidi sono i fissativi più comunemente utilizzati. Vengono utilizzate per stabilizzare i dettagli strutturali di cellule e tessuti prima della microscopia ottica o elettronica. Come la glutaraldeide, anche la paraformaldeide è comunemente usata e si depolimerizza in formalina quando viene riscaldata, diventando così un fissativo efficace.

Perché si usa la glutaraldeide nella microscopia elettronica?

La glutaraldeide è una delle sostanze più frequentemente fissativi utilizzati. Reagisce rapidamente con le proteine e, come dialdeide, stabilizza le strutture mediante reticolazione prima che sia possibile l’estrazione del tampone.

Per evitare la denaturazione della glutaraldeide, è necessario conservarla a 4°C.