A preparação das amostras para a observação em microscopia eletrónica, requer as maiores precauções durante a utilização de várias soluções de acordo com o seu protocolo em várias etapas, o respeito também de vários parâmetros determinantes e muito importantes como:
- o pH /Buffer,
- tipo de tampão de acordo com a amostra,
- Osmolaridade da mistura de aglutinação
- temperatura
- duração da fixação.
The pH of the different cell compartments can vary, so you need to adjust the pH of your buffer solutions according to your studies. In general, in more than 50% of the cases the buffers remain close from 7 to 7.4 A buffer solution maintains approximately the same pH despite the addition of small amounts of an acid or base, or despite dilution.
phosphate or PB: A simple phosphate buffer is used ubiquitously in biological experiments, as it can be adapted to a variety of pH levels, including isotonic. This wide range is due to phosphoric acid having 3 dissociation constants- Fosfato salino ou PBS: O PBS tem muitas utilizações porque é isotónico e não é tóxico para a maioria das células. Estas utilizações incluem a diluição da substância e a lavagem das células. O PBS com EDTA é também utilizado para libertar células aderentes e agrupadas. Este tampão é utilizado em cultura de células em atmosfera controlada em incubadoras com 5% de CO2.
- D-PBS: o DPBS é o PBS de Dulbecco e também conhecido como CMF-PBS (isento de cálcio e magnésio, ou Ca Mg Free). Sem Ca Mg).
- cacodilatos : O tampão cacodilato de sódio [Na (CH3) 2 AsO2 – 3H2O] é uma alternativa ao tampão fosfato de Sørensen. Tem uma boa capacidade de tamponamento do pH na gama de pH 5,0-7,4. O cacodilato foi introduzido em aplicações de microscopia eletrónica por Sabatini et al. (1962) como um método para evitar a adição de fosfatos adicionais às preparações de amostras. As mitocôndrias e outros organelos podem ser danificados quando expostos a concentrações elevadas de fosfatos presentes nos tampões de Sørensen. Além disso, o cacodilato não reage com fixadores de aldeídos como acontece com os tampões que contêm aminas (por exemplo, Tris). A sua eficácia em soluções aglutinantes pode ser o resultado do efeito inibidor do metabolismo do arseniato e não de uma capacidade tamponante especial. Os tampões de Good, ou reagentes formadores de tampões de Good, são uma lista de 20 produtos químicos formadores de tampões seleccionados por Norman Good e a sua equipa, de 1966 a 1980, pela sua adequação para utilização em bioquímica. Estes tampões são designados por “Good’s Buffers”. Vou citar alguns deles utilizados em Microscopia Eletrónica.
- HEPES
- MOPS
- Tris , …
